Cytelligen

循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell, CTC) 在肿瘤转移与复发过程中的作用: 循环肿瘤细胞(CTC)属于外周血循环稀有细胞。这些来自实体肿瘤原发灶 (primary tumor) 的肿瘤细胞侵润血管(主动性内渗,active intravasation),脱落并进入血液循环系统后成为循环肿瘤细胞。随着进入血循环系统,一些CTC变成凋亡细胞 (dying CTC) ,一些则随着血液不断循环 (非转移性CTC,non-metastatic CTC),而另一些CTC (转移性CTC, metastatic CTC) 则可在某一特定器官处粘附、侵润并穿出血管(主动性外渗,active extravasation), 最终形成新的肿瘤转移灶  (metastatic deposit/tumor)。肿瘤复发有着类似的过程。

CTC 的临床与科研意义
美国Cytelligen公司将差相富集 (SE) 与免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交 (iFISH) 成功整合为独特的技术平台。 经临床验证,SE-iFISH 可有效检测病人或肿瘤动物模血液中的循环稀有细胞,包括脱落于各种实体肿瘤的循环肿瘤细胞及其亚类,循环血管内皮细胞,以及干细胞等。
应用 Cytelligen 技术平台分离、检测及分析 CTC 实验流程图
采集血样
  • 病人: 7.5 ml 或任何体积
  • 肿瘤模型鼠:  50-200 μl
其它血液组份检测与分析
  • 血浆: 蛋白及核酸检测
  • 白细胞: 蛋白、核酸检测及功能性研究与分析
差相富集法 (SE) 或超纯净SE 分离循环稀有细胞
  • 非低渗溶破法去除红细胞以及免疫磁珠法去除白细胞
  • 使用非血源性细胞分离介质离心分离肿瘤细胞
  • 对富集的 CTC 无任何损伤
  • 1.5小时内完成样品处理
原代细胞培养富集的 CTC
  • 单克隆或多克隆 CTC 肿瘤细胞原代培养
  • 单细胞分析
  • 建立单克隆或多克隆 CTC 细胞系
  • 构建 CTC 细胞标本库
应用培养的CTC 构建肿瘤动物模型
  • 用培养的单克隆或多克隆不同亚类的 CTC
    细胞构建肿瘤动物模型 ( Monoclonal or
    Polyclonal CTC Derived Xenograft,
    monoclonal or polyclonal - CDX )
鉴别与分析富集的 CTC
富集的单个或多个CTC 可适于后续一系列分析,如蛋白表达,基因突变及形态学检查与研究等
免疫荧光染色液态 CTC (液染)
  • 2 小时内完成实验
  • 更强的荧光亮度
  • 适用于计数免疫荧光染色的 CTC
  • 富集的 CTC 没有经过化学试剂固定,对后续分析实验的潜在干扰小
  • 可使用电动负压细胞吸引器自液体中分离单个染色的 CTC, 以用于后续单细胞全基因组或蛋白分析
i•FISH
®
鉴别或免疫荧光染色固定于玻片上的 CTC (固染)
  • 特殊的细胞固定剂; 特殊的包被及格式化的 CTC 载玻片
  • 适于样本的长期保存
  • 适用于计数免疫荧光染色及iFISH鉴别的 CTC及其亚类
i•FISH
®
鉴别循环肿瘤细胞 (CTC)
  • 使用 iFISH 方法检测肿瘤细胞内非二倍体染色体
  • 可对同一标本同步进行白细胞,角蛋白 (CK), EpCAM, HER2, Vimentin, CD133 及血管内皮细胞免疫荧光染色
  • 3.5 小时内完成 iFISH 及抗体染色
采集图像
  • 通过镜下观察进行人工采集,或借助 Metafer - i•FISH 全自动扫描荧光显微镜进行自动采集
图像分析
  • 对完整或坏死的 CTC 及其亚类中的 CK, EpCAM, HER2, Vimentin, CD133 或其它蛋白以及非二倍体染色体进行分析
  • 对血管内皮细胞 CEC 及其它稀有细胞进行分析
单细胞分析
  • 使用赛特非激光单细胞分离系统(non-laser microscopic single cell manipulator, NMSCM) 自 CTC 包被载玻片上分离经 iFISH 或免疫荧光染色(固染)鉴别出的单个 CTC 或其亚类细胞
  • 适用于后续基因突变、全基因组或蛋白分析等

差相富集技术(Subtraction Enrichment, SE

人体内实体肿瘤细胞为非血源性上皮细胞,其表面表达相应的上皮细胞标示物,如EpCAM。目前有些CTC检测手段借助EpCAM的表达进行CTC的直接捕获。然而EpCAM在不同组织来源的肿瘤细胞上,甚至同一种肿瘤细胞治疗前后的表达具有很大的异质性,表达量高低差异极大,甚至完全不表达(如黑色素瘤),从而导致了依赖EpCAM的CTC检测方法既存在着不可避免的假阴性和不稳定性,同时亦不能通用于检测来自不同肿瘤的CTC,而仅限于有限癌种CTC的检测(乳腺癌,前列腺癌,结直肠癌)。此外,在捕获CTC的过程当中,因抗EpCAM抗体结合并交联(cross-link)了细胞表面的EpCAM分子,从而导致了细胞内信号传导通路 (signal transduction pathway) 的激活,使得CTC不再维持原有的自然状态,故用此类方法捕获的CTC已不适于后续一系列蛋白、基因等的分析。

 

细胞筛是分离CTC的另外一种方法。该方法通过过滤去除白细胞(4-5 微米) 达到分离 CTC 的目的。然而,很多 CTC 大小与白细胞相同,甚至小于白细胞,因而不可避免地会丢失相当数目具有重要临床意义的小的CTC细胞。

 

美国Cytelligen公司(www.cytelligen.com)首次发明了新颖的不依赖于肿瘤上皮细胞表面标示物(如EpCAM等)分离CTC的差相富集技术(Subtraction Enrichment, SE)。SE主要用于从人或肿瘤动物模型的任何体积外周血中有效分离循环稀有细胞(包括循环肿瘤细胞)。其主要作用原理是快速、高效地去除血液中绝大多数的血源性白细胞、红细胞及血浆蛋白,从而达到富集非血源性肿瘤细胞的目的。因富集过程不依赖肿瘤细胞表面标示物的表达,故可通用于所有不同实体肿瘤来源的CTC分离。由于避免了使用低渗溶破法去除红细胞,且富集得到的循环稀有细胞(包括CTC及干细胞等)没有与偶联了抗肿瘤细胞标示物抗体的免疫磁珠结合,亦没有被相应抗体所刺激,所以富集后的肿瘤细胞维持了很好的自然状态,适于后续一系列各种形态学与功能性的相关研究,如免疫荧光染色、瘤标免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交(iFISH)、CTC单细胞基因组分析、蛋白组学分析等。该富集方法也可以有效富集分离各种大小不同的CTC及癌栓(circulating tumor microemboli, CTM)。
实验数据
Cytelligen 免疫磁珠的高特异性:
EpCAM在不同肿瘤细胞上表达与分布的高异质性:
有些肿瘤细胞表面不表达或只表达了很少量的 EpCAM,从而极大地限制了依赖 EpCAM 的方法进行 CTC 检测
免疫荧光染色结果显示,几乎所有结肠癌细胞 (SW480) 的细胞膜表面呈现很强的 EpCAM 表达。胰腺癌 (PANC-1) 及肺癌细胞 (A549) 的 EpCAM表达极弱,且在细胞膜上无表达。个别胰腺癌细胞的细胞核可见 EpCAM 表达(绿色箭头),而大部分肺癌细胞的细胞核 EpCAM 呈弱阳性表达,但有些细胞不表达EpCAM (白色箭头) [Lin, Clin Transl Med 4(38):1-7 (2015)]
流式细胞仪分析结果显示,乳腺癌、膀胱癌及黑色素瘤细胞的 EpCAM 分别为高、低、及无表达。CellSearch 对这些肿瘤细胞的捕获率与 EpCAM 的表达密切相关,而差相富集技术 (SE) 对 EpCAM 不同表达量的肿瘤细胞均有稳定的较高回收率。
差相富集技术(SE)的独有特点
  • 适合于富集循环稀有细胞的Cytelligen免疫磁珠:仅与血源性白细胞相结合而不与非血源性肿瘤上皮细胞结合,从而达到高效、特异地去除白细胞并富集、分离出肿瘤细胞的目的
  • 特殊的Cytelligen非血源性细胞分离介质
  • 适合于iFISH及免疫荧光染色的细胞固定剂
  • 格式化的Cytelligen CTC 包被载玻片:对细胞粘附性强,背景低,尤其适合免疫荧光染色及瘤标-iFISH
  • 不依赖肿瘤细胞自身性状及自身标示物的表达,可通用于所有实体肿瘤CTC的富集与分离;可处理任何体积的人或肿瘤动物模型的生物体液样本 (0.1 - 10 ml 或更多体积的 外周血、胸水、腹水、骨髓、尿液等)
  • 可以有效富集分离各种大小不同的CTC及癌栓(circulating tumor microemboli, CTM)

应用同步实施的瘤标免疫荧光染色 - 染色体荧光原位杂交(TM - i•FISH)整合技术有效鉴别各种CTC亚类细胞

虽然大部分实体肿瘤上皮细胞的内部表达上皮细胞的特有蛋白-角蛋白(Cytokeratin,CK),而且肿瘤细胞的染色体数目异常,呈现多倍体 (polyploid) 或异倍体 (aneuploid),但近年来大量的研究报道指出有些循环肿瘤细胞CTC内的CK会产生降解,而且肿瘤细胞内并非所有的染色体数目都显现异常,所以不论是使用某一特定染色体探针(如7号或8号染色体等)进行染色体数目检测的FISH方法,或是使用CK染色进行肿瘤细胞的识别,两者单独应用都有其自身不可避免的局限性,从而达不到有效鉴别体液中肿瘤细胞的目的。

美国Cytelligen公司首次将区分血源性与非血源性细胞的免疫荧光染色,肿瘤标示物免疫荧光染色 (Tumor Marker immunofluorescence staining ) 及染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridzation,FISH) 成功整合为同步实施的特殊专有技术平台(瘤标-iFISH,TM-iFISH)。TM-iFISH可在区分血源性与非血源性细胞的基础上,对非血源性实体肿瘤上皮细胞(包括CTC)同时进行瘤标染色与iFISH染色体计数的双重手段的检测,以达到对不同亚类的肿瘤细胞进行原位瘤标表型与染色体核型分析的目的 (in situ Phenotyping and Karyotyping of CTC Subtypes, in situ PKCs)。大量临床实验已经证明,相对于传统的细胞形态学检查或目前常规的CK染色判断肿瘤细胞,TM-iFISH具有其它方法无可比拟的高灵敏性与高特异性。根据临床或实验需要,还可加入任何相关瘤标抗体(如抗CA19.9, Her2, CEA,抗干细胞标示物CD133抗体等)进行同步染色。依据特定瘤标表达的有无、强弱及染色体的异常特点,可以发现并确定CTC亚类细胞,从而为进一步探索CTC及其亚类与肿瘤的预后、转移、耐药、复发等的相关性研究提供坚实的基础与可靠的依据。

全自动、高通量扫描与分析CTC图像

赛特生物 (Cytelligen) 与蔡司显微镜公司 (Carl Zeiss) 及世界著名的德国细胞图像公司(MetaSystems) 在全球首次成功开发出了专用于i•FISH

®

检测CTC 的全自动显微荧光扫描与图像分析系统 (Metafer-iFISH

®

)。借助该特有技术平台,可帮助人们在杜绝人为误差的基础上实现全自动、

高通量的不间断图像扫描及CTC图像分析与结果统计。

Metafer-iFISH® 全自动CTC 图像扫描与分析系统的特殊技术优势
  • 高通量 - 自动上片系统确保24小时不间断扫描
  • 全自动 - 对所有CTC细胞图像与原始数据自动进行保存,及数字坐标定位记录与存储
  • 消除人为误差 – 使用系统化识别标准消除了实验人员个体差异造成的CTC判别误差
  • 全方位CTC图像综合分析与统计 – 对获取的CTC 进行单细胞(大、小细胞)及癌栓的区分,并在此基础上对不同类的每一个CTC进行单一或多重瘤标蛋白表达的免疫荧光染色与染色体倍体数目的定量分析,并自动完成对检测结果的各种统计学分析
  • 高效 – 不间断图像扫描、记录、分析、及自动生成检测报告可即时完成
  • 唯一获得国家药监局 (CFDA) 授权证书的细胞图像检测与分析系统,可应用于临床检测

CTC 亚类的临床意义

对个体或根据不同临床指标分组的各种肿瘤病人(或肿瘤动物模型)的 CTC 进行亚类鉴别与分析,通过比较治疗前、后的CTC 亚类细胞数目的变化,可以确定某一 CTC 亚类与特定临床结果或临床转归(包括预后评估、肿瘤转移、耐药及复发等)的相关性。与其它常见的仅限于分离混合的 EpCAM+/CK8/18/19+ CTC 的方法不同,不依赖于 EpCAM 及·CK 表达的 SE-iFISH 检测出的 CTC 亚类涵盖了更多不同种类的 CTC 细胞。这些 CTC 亚类细胞能够帮助人们在精确锁定的单个肿瘤细胞上开展更加特异、且更有明确临床指导意义的基因突变检测、全基因组测序以及其它各种蛋白及功能性的相关研究。

差相富集技术 (SE) 与瘤标-iFISH  (TM-iFISH) 的特有技术优势

  • 快速、准确、高效、灵敏、特异、简便、通用
  • 适用于人及肿瘤动物模型(鼠)任何体积的生物体液标本
  • 通用于分离外周血、胸腹水、脑脊液、尿液等来自各种实体瘤的肿瘤细胞
  • 分离的肿瘤细胞适于后续的原代细胞培养
  • 可分离干细胞,以及血液内其它组份,如白细胞、血浆蛋白及核酸等
  • 适于检测各种大小不同的CTC亚类细胞及癌栓
  • 适于后续单细胞的基因组、蛋白组学等方面的研究
  • 因“异倍体肿瘤相关血管内皮细胞”(heteroploid tumor-associated endothelial cells, hTECs) 在CTC富集过程中已得到有效去除,故不存在此类细胞在CTC识别过程中造成的假阳性
    , the real solutions for circulating rare cells......
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